โครมาโทกราฟี

โครมาโตกราฟีประเภทที่ใช้กันบ่อยมากที่สุดได้แก่การทำโครมาโตกราฟีก๊าซและของเหลว ความแตกต่างอยู่ที่สภาวะทางกายภาพของเฟสเคลื่อนที่ในคอลัมน์ของโครมาโตกราฟี สำหรับโครมาโตกราฟีแบบก๊าซ เฟสเคลื่อนที่หมายถึงก๊าซที่นำพาตัวอย่างผ่านเฟสหยุดนิ่งของแข็ง ที่ซึ่งโครมาโตกราฟีแบบของเหลวในเฟสเคลื่อนที่จะเป็นสารละลาย ปฏิกิริยาของสารประกอบกับเฟสหยุดนิ่ง คือกระบวนการที่รู้จักในโหมดของการแยก ซึ่งมีการควบคุมโดยความแตกต่างของสภาพขั้ว ขนาด หรือสัมพรรคภาพพันธะจำเพาะต่างๆ โหมดวิธีโครมาโตกราฟีในการคัดแยกที่กำหนดประเภทของเทคนิคการโครมาโตกราฟีแบบของเหลว (ตารางที่ 1) 

ตารางที่ 1 ประเภทโครมีโตกราฟีแบบของเหลว

ขั้นตอนการทำให้บริสุทธิ์ด้วยโครมาโตกราฟี

โครมาโตกราฟีด้วยคอลัมน์ดูดซับคือส่วนหลักของขั้นตอนการแยกและทำให้บริสุทธิ์สำหรับยา สารเคมี วัตถุปรุงรส และอื่นๆ โดยเริ่มแรก จะมีการสังเคราะห์หรือแยกสกัดสารเคมีจากพืช แบคทีเรีย หรือสิ่งมีชีวิตอื่นๆ แล้วใช้การระเหยเพื่อทำให้วัสดุมีความเข้มข้นเพื่อให้ง่ายต่อกระบวนการทำงานต่อไปในภายหลัง หากเป็นตัวอย่างใหม่ที่ยังไม่คุ้นเคย จะมีการหาสภาวะการแยกด้วยโครมาโตกราฟีที่เหมาะสม ซึ่งมักจะเป็นการทำโครมาโตกราฟีด้วยชั้นบาง (Thin-Layer Chromatography - TLC) หรือโครมาโตกราฟีของเหลวแรงดันสูงเพื่อการวิเคราะห์ (High-Pressure Liquid Chromatography - HPLC) เมื่อได้สภาวะที่เหมาะสมแล้ว จึงเพิ่มปริมาณการแยกสารเป็นการทำโครมาโตกราฟีเพื่อเตรียมตัวอย่าง ในขั้นตอนการเตรียมตัวอย่าง จะมีการทำให้สารประกอบเป้าหมายบริสุทธิ์ในปริมาณมากไม่ว่าจะด้วยการทำแฟลชโครมาโตกราฟี, Prep HPLC, หรือใช้ร่วมกันทั้งสองวิธี หากใช้เทคนิคทั้งสองร่วมกัน จะใช้แฟลชโครมาโตกราฟีเพื่อเตรียมพร้อมก่อนการทำให้บริสุทธิ์และใช้ Prep HPLC เพื่อให้ได้ความบริสุทธิ์ขั้นสุดท้ายสูงตามที่กำหนด

หลังจากแยกสารประกอบสำเร็จ จะดำเนินการต่อเพื่อให้ได้ความเข้มข้นที่ต้องการด้วยการทำให้ระเหยหรือการแช่เยือกแข็ง ที่จุดนี้ สารประกอบจะพร้อมแล้วสำหรับการวิเคราะห์หาความบริสุทธิ์และฟังก์ชันการทำงานด้วยเทคนิคอื่นๆ รวมไปถึงการวิเคราะห์จุดหลอมเหลว, การทำ HPLC เชิงวิเคราะห์, การวิเคราะห์เอนไซม์ และอื่นๆ อีกมากมาย

ขั้นตอนการทำงานทั้งหมดหลังจากสังเคราะห์หรือแยกสกัดจะแสดงไว้ในภาพที่ 1

ภาพที่ 1 ขั้นตอนการทำให้บริสุทธิ์ในขั้นตอนการแยกสกัดหรือสังเคราะห์ทั่วไป

โครมาโตกราฟีคอลัมน์ดูดซับเป็นรูปแบบแรกๆ ของการทำโครมาโตกราฟีของเหลว ซึ่งค้นพบมาเป็นเวลากว่า 100 ปีที่แล้วโดย Mikhail Tsvet นักพฤกษศาสตร์สัญชาติรัสเซีย-เยอรมันที่ใช้ขั้นตอนโครมาโตกราฟีประเภทนี้เพื่อแยกพิกเมนต์สีออกจากพืช หลังจากนั้น จึงมีการพัฒนาเทคนิคโครมาโตกราฟีอย่างรวดเร็วจนเกิดวิธีที่สำคัญที่ใช้ในห้องปฏิบัติการเพื่อสังเคราะห์หรือแยกสกัดต่างๆ

สำหรับโครมาโตกราฟีดูดซับ การแยกสารเกิดจากอันตรกิริยาขององค์ประกอบตัวอย่างกับเฟสหยุดนิ่งและเฟสเคลื่อนที่ สารประกอบที่มีคุณสมบัติทางเคมีที่ต่างกัน (ความมีขั้ว) จะแสดงสัมพรรคภาพ หรือความแข็งแรงในการยึดเกาะที่ต่างกันไปในเฟสเคลื่อนที่และเฟสหยุดนิ่ง สัมพรรคภาพจะมีผลจากคุณสมบัติทางเคมีสองประการ คือการดูดซับและการปล่อย การดูดซับหมายถึงความสามารถที่องค์ประกอบบางอย่างจะยึดเกาะอยู่กับเฟสหยุดนิ่ง การปล่อยหรือความสามารถในการทำละลาย จะอธิบายถึงความสามารถที่องค์ประกอบของสารผสมละลายได้ในเฟสเคลื่อนที่ สำหรับความเร็วที่องค์ประกอบตัวอย่างแต่ละชนิดจะเคลื่อนผ่านเฟสหยุดนิ่งนั้นขึ้นอยู่กับคุณสมบัติในการดูดซับ/ปล่อยดังที่แสดงไว้ในภาพที่ 2

ภาพที่ 2: การดูดซับ เทียบกับ การคายความชื้น  

แฟลชโครมาโตกราฟี เทียบกับเทคนิค Prep HPLC 

ส่วนที่แสดงในส่วนแรกจะใช้แรงดันที่เพิ่มขึ้นซึ่งใช้ในช่วงปลายศตวรรษที่ 17 ด้วยวิธีที่เรียกว่า แฟลชโครมาโตกราฟี นอกจากนี้ ยังมีความพยายามที่จะเพิ่มขนาดของระบบ HPLC เชิงวิเคราะห์และทำให้ใช้ได้ในการทำโครมาโตกราฟีเพื่อเตรียมตัวอย่าง (Prep HPLC) ปัจจุบัน เทคนิคทั้งสองต่างเป็นที่นิยมใช้เพื่อวัตถุประสงค์ต่างๆ: โดยแฟลชโครมาโตกราฟีจะใช้ในขั้นตอนการเตรียมความบริสุทธิ์เป็นหลัก เพื่อทำให้ตัวอย่างปริมาณมากมีความบริสุทธิ์ในระดับความละเอียดสูง ซึ่งการทำ Prep HPLC มีเป้าหมายในการทำให้ได้ความละเอียด (ความบริสุทธิ์) สูงสุดภายใต้เงื่อนไขความจุโหลดที่ต่ำลง

ดังนั้น เทคนิคโครมาโตกราฟีทั้งสองจึงแตกต่างกันในวัสดุที่ใช้สำหรับเฟสหยุดนิ่ง (ขนาดอนุภาคต่างกัน) ซึ่งขนาดของตลับหรือคอลัมน์ (เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน (Internal Diameter - ID) และความยาว) รวมถึงอัตราการไหลในเฟสเคลื่อนที่ดังที่แสดงในตารางที่ 2

ตารางที่ 2 ความแตกต่างระหว่างแฟลชโครมาโตกราฟีและ Prep HPLC