Хроматография

Наиболее часто используемые типы хроматографии – это газовая и жидкостная хроматография. Отличие между двумя типами заключается в физическом состоянии подвижной фазы в хроматографической колонке. В газовой хроматографии подвижной фазой является газ, который вместе с компонентами анализируемой смеси передвигается вдоль неподвижной фазы, в жидкостной хроматографии – растворитель. Взаимодействие компонентов смеси с неподвижной фазой, т. е. процесс их распределения, зависит от полярности, размера молекул или сродства к связыванию. Характер процесса распределения компонентов разделяемой смеси определяет тип жидкостной хроматографии (таблица 1). 

Таблица 1. Типы жидкостной хроматографии 

Процедура хроматографической очистки 

Адсорбционная колоночная хроматография – основная процедура разделения и очистки компонентов при производстве лекарств, химических веществ, ароматизаторов и пр. Сначала компоненты синтезируются химическим путем или экстрагируются из растений, бактерий или других живых организмов. Упаривание образца для получения экстракта осуществляется с целью упрощения последующей обработки. Если образец новый и незнакомый, выполняется проверка оптимальных условий хроматографического разделения, обычно с помощью методов тонкослойной хроматографии (ТСХ) или аналитической жидкостной хроматографии высокого давления (ВЭЖХ). Когда оптимальные условия хроматографического анализа определены, образец помещают в препаративную колонку. На этапе препаративной хроматографии целевое соединение очищают в больших количествах с помощью флэш-хроматографии, препаративной ВЭЖХ или их комбинации. Если используются оба метода, флэш-хроматография применяется на стадии предварительной очистки, препаративная ВЭЖХ – для получения высокочистых соединений. После успешного разделения компонентов смеси выполняется второй этап концентрирования с использованием метода упаривания или лиофильной сушки. На этой стадии соединение готово для анализа его чистоты и структуры другими методами, включая определение точки плавления, аналитическую ВЭЖХ, ферментативные анализы и пр.

Полный процесс работы с образцом после синтеза или экстракции изображен на рис.1.

Рисунок 1. Процесс очистки соединения в ходе экстракции или синтеза. 

Адсорбционная колоночная хроматография – первый тип жидкостной хроматографии, созданный более 100 лет назад Михаилом Цветом, русско-итальянским ботаником, который использовал этот тип хроматографического анализа для разделения пигментов листьев растений. С тех пор метод жидкостной хроматографии очень быстро стал основным и использовался для лабораторного синтеза и экстракции.  

В адсорбционной хроматографии процесс разделения смеси компонентов определяется их взаимодействием с неподвижной и подвижной фазами. Соединения с разными химическими свойствами (полярностями) демонстрируют различное сродство или аффинность к подвижной или неподвижной фазе. На аффинность влияют два молекулярных свойства: адсорбция и десорбция. Адсорбция означает способность компонента удерживаться на поверхности неподвижной фазы. Десорбция или растворимость означает способность компонента растворяться в подвижной фазе. Скорость, с которой компоненты анализируемой смеси движутся через неподвижную фазу, зависит от их адсорбционных/десорбционных свойств, как показано на рис. 2. 

Рис. 2: Адсорбция и десорбция  

Флэш-хроматография и препаративная ВЭЖХ

Первая статья о хроматографии высокого давления, которая получила название флэш-хроматографии, вышла в конце семидесятых годов ХХ века. В дополнение к этому были предприняты попытки увеличить размер колонок для ВЭЖХ и, таким образом, сделать возможным их применение для препаративной хроматографии (препаративная ВЭЖХ). В настоящее время часто используются оба метода, но для разных целей: флэш-хроматография в основном используется на стадии предварительной очистки для очистки больших объемов образца с удовлетворительным разрешением, тогда как при препаративной ВЭЖХ целью является достижение наивысшего разрешения (чистоты) при условии более низких объемов.

Следовательно, два хроматографических метода различаются типом сорбента (разный размер частиц), объемом картриджа или колонки (внутренний диаметр (ID) и длина) и скоростью потока подвижной фазы, как показано в таблице 2.

Таблица 2. Различия между флэш-хроматографией и препаративной ВЭЖХ