Kromatografi

Jenis kromatografi yang paling sering digunakan adalah kromatografi gas atau cair. Perbedaannya berkaitan dengan keadaan fisika fase gerak di dalam kromatografi kolom. Pada kromatografi gas, fase geraknya adalah gas yang mengangkut sampel melalui fase diam berbentuk padat, sementara kromatografi cair menggunakan pelarut sebagai fase gerak. Interaksi senyawa dengan fase diam, proses yang dikenal sebagai mode pemisahan, diatur oleh perbedaan dalam polaritas, ukuran, atau afinitas pengikatan spesifik. Mode yang digunakan dalam metode pemisahan kromatografi menentukan jenis teknik kromatografi cair (Tabel 1). 

Tabel 1. Jenis kromatografi cair

Alur kerja pemurnian kromatografi

Kromatografi kolom adsorpsi adalah bagian utama alur kerja isolasi dan pemurnian umum untuk obat-obatan, bahan kimia, perisa, dan bahan lain. Pada awalnya, zat disintesis secara kimia atau diekstraksi dari tanaman, bakteri, atau organisme hidup lain. Evaporasi digunakan untuk memekatkan bahan tersebut untuk menyederhanakan pemrosesan hilir. Jika sampel tersebut baru dan belum dikenali, dilakukan penyaringan untuk kondisi pemisahan kromatografi yang optimal, biasanya dengan metode kromatografi lapis tipis (TLC) atau kromatografi cair tekanan tinggi (HPLC) analitis. Setelah kondisi yang sesuai ditemukan, proses kromatografi ditingkatkan menjadi kromatografi preparatif. Dalam tahap preparatif, senyawa target dimurnikan dalam jumlah besar melalui kromatografi flash, HPLC preparatif, atau kombinasi keduanya. Jika teknik tersebut digunakan bersama-sama, kromatografi flash diterapkan untuk langkah pemurnian awal dan HPLC preparatif untuk mencapai kemurnian

akhir yang tinggi. Setelah pemisahan senyawa berhasil, langkah pemekatan kedua dilakukan melalui evaporasi atau pengeringan beku. Pada titik ini, senyawa tersebut siap dianalisis kemurnian dan fungsinya menggunakan teknik lain, termasuk analisis titik leleh, HPLC analitis, asai enzimatik, dan lainnya.

Alur kerja lengkap setelah sintesis atau ekstraksi ditampilkan dalam Gambar 1.

Gambar 1. Alur kerja pemurnian dalam alur kerja ekstraksi atau sintesis umum

Kromatografi kolom adsorpsi adalah kromatografi cair bentuk paling pertama, yang ditemukan lebih dari 100 tahun lalu oleh Mikhail Tsvet, ahli botani Rusia-Italia yang menggunakan jenis proses kromatografi ini untuk memisahkan pigmen di dalam tumbuhan. Sejak saat itu, teknik kromatografi telah berkembang sangat cepat menjadi metode penting yang digunakan di laboratorium sintesis dan ekstraksi.  

Dalam kromatografi adsorpsi, pemisahan ditentukan oleh interaksi komponen sampel dengan fase diam dan fase gerak. Senyawa dengan sifat kimia (polaritas) yang berbeda menunjukkan afinitas, atau kekuatan adhesi, yang berbeda terhadap fase gerak dan fase diam. Afinitas dipengaruhi oleh dua sifat molekul, adsorpsi dan desorpsi. Adsorpsi merupakan kemampuan komponen tertentu untuk menempel pada fase diam. Desorpsi, atau kelarutan, menjelaskan seberapa baik komponen campuran tersebut terlarut dalam fase gerak. Kecepatan komponen sampel masing-masing yang bermigrasi melalui fase gerak tergantung pada sifat adsorpsi/desorpsinya sebagaimana ditampilkan dalam Gambar 2. 

Gambar 2. Adsorpsi versus desorpsi

Teknik kromatografi flash vs HPLC preparatif

Publikasi pertama yang menggunakan tekanan yang ditingkatkan diterbitkan di akhir tahun tujuh puluhan dengan metode yang disebut sebagai kromatrografi flash. Selain metode ini, dilakukan upaya untuk meningkatkan ukuran sistem HPLC analitis sehingga menjadikannya juga dapat digunakan untuk kromatografi preparatif (HPLC preparatif). Saat ini, kedua teknik sering digunakan, tetapi untuk tujuan yang berbeda: kromatografi flash utamanya digunakan sebagai langkah pemurnian awal untuk memurnikan sampel dalam jumlah besar pada resolusi yang memadai, sementara target HPLC preparatif adalah untuk mencapai resolusi (kemurnian) tertinggi pada kondisi kapasitas muatan yang lebih kecil.

Oleh karena itu, kedua teknik kromatografi ini berbeda dalam hal bahan yang digunakan untuk fase gerak (ukuran partikel yang berbeda), dimensi kartrid atau kolom (diameter dalam (ID) dan panjang), dan laju aliran fase gerak sebagaimana ditampilkan dalam Tabel 2.

Tabel 2. Perbedaan antara kromatografi flash dan HPLC preparatif