Cromatografia

I tipi di cromatografia più utilizzati sono la cromatografia gassosa o quella liquida. La differenza è legata allo stato fisico della fase mobile nella cromatografia su colonna. Nella cromatografia gassosa (o gascromatografia), la fase mobile è un gas che trasporta il campione attraverso una fase stazionaria solida, mentre nella cromatografia liquida la fase mobile è un solvente. L’interazione dei composti con la fase stazionaria, un processo noto come modalità di separazione, è governata da differenze di polarità, dimensioni o affinità di legame specifiche. La modalità del metodo cromatografico di separazione determina il tipo di tecnica di cromatografia liquida (Tabella 1). 

Tabella 1. Tipi di cromatografia liquida 

Flusso di lavoro della purificazione cromatografica 

La cromatografia su colonna ad adsorbimento è la parte principale di un tipico flusso di lavoro di isolamento e purificazione per farmaci, prodotti chimici, aromi e altro. Inizialmente, le sostanze vengono sintetizzate chimicamente o estratte da piante, batteri o altri organismi viventi. L’evaporazione viene utilizzata per concentrare il materiale per semplificare la lavorazione a valle. Se il campione è nuovo e poco familiare, viene eseguito uno screening per condizioni di separazione cromatografica ottimali, di solito mediante cromatografia a strato sottile (TLC) o metodi analitici di cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC). Una volta trovate le condizioni adatte, il processo cromatografico viene scalato alla cromatografia preparativa. Nella fase preparatoria, il composto target viene purificato in quantità elevate mediante cromatografia flash, prep HPLC o una combinazione di entrambi i metodi. Se le tecniche vengono utilizzate insieme, la cromatografia flash viene applicata per la fase di pre-purificazione, mentre la prep HPLC viene applicata per ottenere un’elevata purezza finale. Dopo aver separato con successo i composti, viene eseguita una seconda fase di concentrazione mediante evaporazione o liofilizzazione. A questo punto, il composto è pronto per l’analisi della sua purezza e funzione con altre tecniche, tra cui l’analisi del punto di fusione, l’HPLC analitica, dosaggi enzimatici e altro.

Il flusso di lavoro completo dopo la sintesi o l’estrazione è mostrato in Fig. 1.

Figura 1. Il flusso di lavoro di purificazione in un flusso di lavoro generale di estrazione o sintesi

La cromatografia su colonna ad adsorbimento è stata la primissima forma di cromatografia liquida, scoperta oltre 1 secolo fa da Mikhail Tsvet, un botanico russo-italiano che utilizzò questo tipo di processo cromatografico per separare i pigmenti nelle piante. Da allora, la tecnica della cromatografia si è sviluppata molto rapidamente in un metodo essenziale utilizzato nei laboratori di sintesi ed estrazione.  

Nella cromatografia di adsorbimento, la separazione è governata dalle interazioni dei componenti del campione con la fase stazionaria e mobile. Composti con proprietà chimiche (polarità) diverse mostrano affinità, o forze di adesione, variabili verso la fase mobile e la fase stazionaria. L’affinità è influenzata da due proprietà molecolari, l’adsorbimento e il desorbimento. L’adsorbimento si riferisce alla capacità di un certo componente di aderire alla fase stazionaria. Il desorbimento, o solubilità, descrive quanto bene un componente della miscela si dissolve nella fase mobile. La velocità con cui i singoli componenti del campione migrano attraverso la fase stazionaria dipende dalle loro proprietà di adsorbimento/desorbimento come mostrato in Fig. 2. 

Figura 2. Adsorbimento e desorbimento  

Differenze tra cromatografia flash e tecnica prep HPLC 

La prima pubblicazione sull’uso della pressione elevata venne fuori alla fine degli anni settanta con un metodo denominato cromatografia flash. Oltre a questo, furono fatti tentativi per aumentare le dimensioni dei sistemi HPLC analitici e renderli così disponibili anche per la cromatografia preparativa (prep HPLC). Al giorno d’oggi, entrambe le tecniche sono frequentemente utilizzate ma per obiettivi diversi: la cromatografia flash è utilizzata principalmente come fase di pre-purificazione per purificare grandi quantità di campione a una risoluzione decente, mentre nella prep HPLC l’obiettivo è quello di ottenere la massima risoluzione (purezza) in condizioni di capacità di carico inferiori.  

Pertanto, le due tecniche cromatografiche differiscono nel materiale utilizzato per la fase stazionaria (diversa dimensione delle particelle), la dimensione della cartuccia o colonna (diametro interno (DI) e lunghezze) e la velocità di flusso della fase mobile, come mostrato nella tabella 2.

Tabella 2. Differenze tra cromatografia flash e prep HPLC