Chromatographie
Différents types de techniques de chromatographie
La technique de chromatographie est l’une des méthodes les plus puissantes pour séparer un échantillon, tel qu’un mélange de synthèse ou un extrait biologique brut, en composants individuels. La technique de séparation chromatographique repose sur la séparation des substances entre deux phases : une phase stationnaire avec une grande surface et une phase mobile qui se déplace à travers la phase stationnaire.
Les types de chromatographie les plus fréquemment utilisés sont la chromatographie en phase gazeuse ou en phase liquide. La différence est attribuable à l’état physique de la phase mobile en chromatographie sur colonne. Dans la chromatographie en phase gazeuse, la phase mobile est un gaz qui véhicule l’échantillon à travers une phase stationnaire solide, tandis que dans la chromatographie en phase liquide, la phase mobile est un solvant. L’interaction des composés avec la phase stationnaire, un processus connu sous le nom de mode de séparation, est régie par les différences de polarité, de taille ou d’affinités de liaison spécifiques. La méthode de séparation du mode de chromatographie détermine le type de technique de chromatographie en phase liquide (tableau 1).
Tableau 1. Types de chromatographie en phase liquide
| Types de chromatographie en phase liquide | Mode de séparation chromatographique reposant sur : |
| Chromatographie d’absorption (en phase normale ou inversée) | Polarité |
| Chromatographie d’affinité | Interaction de liaison spécifique |
| Chromatographie d’exclusion stérique | Tailles moléculaires |
| Chromatographie par échange d’ions | Charge |
Processus de purification chromatographique
La chromatographie d’adsorption sur colonne constitue la partie principale d’un processus type d’isolation et de purification pour les médicaments, les produits chimiques, les arômes et autres. Au départ, les substances sont chimiquement synthétisées ou extraites à partir de plantes, de bactéries ou d’autres organismes vivants. L’évaporation sert à concentrer la matière pour simplifier la transformation en aval. Si l’échantillon est nouveau et inconnu, une recherche est effectuée pour obtenir des conditions de séparation chromatographique optimales, généralement par méthodes de chromatographie en couche mince (CCM) ou chromatographie analytique en phase liquide à hautes performances (HPLC). Une fois les conditions adaptées réunies, le procédé de chromatographie est converti en chromatographie préparative. Dans la phase préparative, le composé cible est purifié en quantités élevées par chromatographie flash, HPLC préparative ou une combinaison des deux. Si les techniques sont utilisées ensemble, la chromatographie flash est appliquée à l’étape de prépurification et la HPLC préparative pour atteindre la pureté élevée finale. Une fois les composés séparés, une deuxième étape de concentration est effectuée soit par évaporation, soit par lyophilisation. À ce stade, le composé est prêt pour l’analyse de sa pureté et de son fonctionnement par d’autres techniques, notamment l’analyse du point de fusion, la HPLC préparative, les essais enzymatiques et autres.
Le processus complet après synthèse ou extraction est illustré à la Fig. 1.
Figure 1. Processus de purification dans un processus d’extraction ou de synthèse général
La chromatographie d’adsorption sur colonne fut la toute première forme de chromatographie en phase liquide, découverte il y a plus de 100 ans par Mikhail Tsvet, un botaniste russo-italien qui utilisait ce type de procédé chromatographique pour séparer les pigments dans des plantes. Depuis lors, la technique de chromatographie est très rapidement devenue une méthode essentielle utilisée dans les laboratoires de synthèse et d’extraction.
Dans la chromatographie d’adsorption, la séparation est régie par les interactions des composants de l’échantillon avec la phase stationnaire et la phase mobile. Les composés ayant des propriétés chimiques différentes (polarités) montrent des affinités (ou forces d’adhésion) variables envers la phase mobile et la phase stationnaire. L’affinité est influencée par deux propriétés moléculaires, l’adsorption et la désorption. L’adsorption fait référence à la capacité d’un certain composant à adhérer à la phase stationnaire. La désorption, ou solubilité, décrit la façon dont un composant du mélange se dissout dans la phase mobile. La vitesse à laquelle chacun des composants de l’échantillon se déplace dans la phase stationnaire dépend de ses propriétés d’adsorption/de désorption comme l’illustre la Fig. 2.
Figure 2. Adsorption versus désorption
Technique de chromatographie flash versus HPLC préparative
La première publication utilisant la pression élevée est apparue à la fin des années 70, avec une méthode dénommée « chromatographie flash ». En outre, on a tenté d’augmenter la taille des systèmes de HPLC analytique et donc de les rendre également disponibles pour la chromatographie préparative (HPLC prep). De nos jours, les deux techniques sont fréquemment utilisées, mais à des fins différentes : la chromatographie flash est principalement utilisée comme étape de prépurification pour purifier de grandes quantités d’échantillons à une résolution convenable, tandis que l’objectif de la HPLC préparative est d’atteindre une résolution (pureté) plus élevée sous réserve de capacités de charge inférieures.
La différence entre les deux techniques de chromatographie réside donc dans la matière utilisée pour la phase stationnaire (taille différente des particules), la dimension de la cartouche ou de la colonne (diamètre interne [DI] et longueurs) et le débit de la phase mobile, comme l’illustre le Tableau 2.
Tableau 2. Différences entre la chromatographie flash et la HPLC préparative
Chromatographie flash | HPLC préparative | |
|---|---|---|
Taille des particules | 15 – 63 µm | 5 – 15 µm |
DI de la colonne | 12 – 115 mm | 10 – 70 mm |
Débit | 15 – 250 ml/min | 5 – 100 ml/min |
Capacité de charge | < 300 g | < 10 g |
Pression maximale | 50 bars | 300 bars |
