Chromatographie
Verschiedene Chromatographie-Techniken
Die Chromatographie ist eine der leistungsfähigsten Methoden zur Trennung von Proben in ihre einzelnen Bestandteile, wie bspw. synthetisierten Gemischen oder biologischen Rohextrakten. Die chromatographische Trennung beruht auf der Partitionierung von Substanzen zwischen zwei Phasen: einer stationären Phase mit einer grossen Oberfläche und einer mobilen Phase, die sich durch die stationäre Phase hindurchbewegt.
Die am häufigsten verwendeten Chromatographie Techniken sind die Gas- und die Flüssigkeitschromatographie. Der Unterschied hängt mit dem physikalischen Zustand der mobilen Phase zusammen. Bei der Gaschromatographie ist die mobile Phase ein Gas, das die Probe durch eine feste stationäre Phase hindurch befördert. Bei der Flüssigkeitschromatographie hingegen ist die mobile Phase ein Lösungsmittel. Die Wechselwirkung der Substanzen mit der stationären Phase, ein als Trennmodus bezeichneter Prozess, wird von den Unterschieden hinsichtlich der Polarität, der Grösse oder der spezifischen Bindungsaffinitäten bestimmt. Der Modus der chromatographischen Trennmethode bestimmt den Typ der Flüssigkeitschromatographie-Technik (Tabelle 1).
Tabelle 1. Flüssigkeitschromatographie-Techniken
| Flüssigkeitschromatographie-Techniken | Modus der chromatographischen Trennung, beruhend auf: |
| Adsorptionschromatographie (Normal- und Umkehrphasenchromatographie) | Polarität |
| Affinitätschromatographie | Spezifische Bindungswechselwirkung |
| Grössenausschlusschromatographie | Molekülgrössen |
| Ionenaustauschchromatographie | Ladung |
Arbeitsschritte bei der chromatographischen Trennung
Die Adsorptionschromatographie ist der Hauptarbeitsschritt bei der Isolierung und Aufreinigung von Arzneimitteln, Chemikalien, Geschmacksstoffen und sonstige Substanzen. Die Substanzen werden zunächst chemisch synthetisiert oder aus Pflanzen, Bakterien oder anderen lebenden Organismen extrahiert. Durch Destillieren wird das Material dann konzentriert, um die weitere Verarbeitung zu erleichtern. Wenn es sich um eine neue und unbekannte Probe handelt, wird ein Screening im Hinblick auf die optimalen Bedingungen für die chromatographische Trennung durchgeführt, üblicherweise mittels Dünnschichtchromatographie (TLC) oder analytischer Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC). Nachdem geeignete Bedingungen ermittelt sind, wird die Trennung auf die präparative Chromatographie hochskaliert. Beim präparativen Schritt wird die Zielverbindung in grossen Mengen mittels Flash-Chromatographie, präparativer HPLC oder einer Kombination aus beiden gereinigt. Werden die Techniken gemeinsam eingesetzt, so wird die Flash-Chromatographie für den Vorreinigungsschritt verwendet und die präparative HPLC zum Erzielen der hohen Reinheit.
Nach erfolgreicher Trennung der Verbindungen wird ein zweiter Konzentrationsschritt durchgeführt, entweder in Form von Destillation oder Gefriertrocknung. Nunmehr können die Reinheit und Funktion der Verbindung mittels anderer Techniken ermittelt werden, u. a. durch Schmelzpunktanalyse, analytische HPLC, enzymatische Assays und sonstige Methoden.
Die Arbeitsschritte nach der Synthese oder Extraktion sind in Abb. 1 dargestellt.
Abbildung 1. Arbeitsschritte nach einer Extraktion oder Synthese
Die Adsorptionssäulenchromatographie war die allererste Form der Flüssigkeitschromatographie. Sie wurde vor 100 Jahren von Mikhail Tsvet, einem russisch-italienischen Botaniker, erfunden, der diese Art von Chromatographie-Prozess zur Trennung von Pflanzenpigmenten einsetzte. Seither hat sich die Chromatographie-Technik rasant weiterentwickelt und ist zu einer unerlässlichen Methode für Synthese- und Extraktionslabors geworden.
Bei der Adsorptionschromatographie erfolgt die Trennung durch die Wechselwirkungen der Probenbestandteile mit der stationären und der mobilen Phase. Verbindungen mit unterschiedlichen chemischen Eigenschaften (Polaritäten) zeigen verschiedene Affinitäten, oder Bindungsstärken, gegenüber der mobilen Phase und der stationären Phase. Die Affinität wird durch zwei molekulare Eigenschaften beeinflusst, nämlich durch die Adsorption und die Desorption. Als Adsorption bezeichnet man die Fähigkeit einer bestimmten Substanz an der stationären Phase anzuhaften. Die Desorption, oder Löslichkeit, beschreibt, wie gut sich ein Bestandteil des Gemisches in der mobilen Phase löst. Die Geschwindigkeit, mit welcher die einzelnen Probenbestandteile durch die stationäre Phase migrieren, ist abhängig von ihren Adsorptions-/Desorptionseigenschaften (siehe Abb. 2).
Abbildung 2. Adsorption im Unterschied zur Desorption
Die Flash-Chromatographie im Unterschied zur Technik der präparativen HPLC
Die erste Veröffentlichung zum Einsatz von Hochdruck berichtete Ende der 70er Jahre von einer als Flash-Chromatographie bezeichneten Methode. Ausserdem versuchte man, die Grösse der HPLC-Analysensysteme so anzupassen, dass sie auch für die präparative Chromatographie (präparative HPLC) einsetzbar sind. Heute kommen beide Techniken häufig zum Einsatz, jedoch für unterschiedliche Zielsetzungen: Die Flash-Chromatographie wird hauptsächlich als Vorreinigungsschritt zur Trennung grosser Probenmengen in guter Auflösung eingesetzt, während die präparative HPLC die höchste Auflösung (Reinheit) als Ziel hat unter der Bedingung von niedrigeren Probenmengen.
Daher unterscheiden sich die beiden Chromatographie-Techniken hinsichtlich der für die stationäre Phase verwendeten Materialien (unterschiedliche Partikelgrösse), der Kartuschen- oder Säulenabmessungen (Innendurchmesser [ID] und Länge) sowie der Durchflussrate der mobilen Phase. Siehe hierzu Tabelle 2.
Tabelle 2. Unterschiede zwischen Flash-Chromatographie und präparativer HPLC
Flash-Chromatographie | Präparative HPLC | |
|---|---|---|
Partikelgrösse | 15 – 63 µm | 5 – 15 µm |
Säulen-ID | 12 – 115 mm | 10 – 70 mm |
Durchflussrate | 15 – 250 mL/min | 5 – 100 mL/min |
Probenladekapazität | < 300 g | < 10 g |
Druck | 50 bar | 300 bar |
