크로마토그래피

가장 흔하게 사용되는 크로마토그래피 유형은 가스 크로마토그래피 또는 액체 크로마토그래피입니다. 두 유형의 차이점은 컬럼 크로마토그래피 내 이동상의 물리적 상태와 관련되어 있습니다. 가스 크로마토그래피의 경우 이동상은 고체 고정상을 따라 샘플을 이동시키는 가스이지만, 액체 크로마토그래피의 이동상은 용매입니다. 고정상에서 화합물의 상호 작용은 분리 모드라고 알려져 있는 공정으로, 극성, 크기, 또는 특정 결합 친화성의 차이에 따라 달라집니다. 크로마토그래피 분리 방법의 모드는 액체 크로마토그래피 기법의 유형을 결정합니다(표 1). 

표 1. 액체 크로마토그래피의 유형

크로마토그래피 정제 워크플로우 

흡착 컬럼 크로마토그래피는 약물, 화학물질, 향미 및 기타 물질에 대한 일반적인 분리 및 정제 워크플로우의 가장 중요한 부분입니다. 먼저 물질을 화학적으로 합성하거나 식물, 박테리아 또는 기타 생물로부터 추출합니다. 물질을 농축하여 분리정제 처리를

간소화하기 위해 증발이 사용됩니다. 샘플이 새롭고 익숙하지 않은 경우, 일반적으로는 박층 크로마토그래피(TLC) 또는 분석용 고압 액체 크로마토그래피(HPLC) 분석법을 활용하여 최적의 크로마토그래피 분리 조건을 찾기 위한 스크리닝을 수행합니다. 일단 적합한 조건을 찾아내면 크로마토그래피 공정을 분취 크로마토그래피로 업스케일합니다. 분취 단계에서는 플래시 크로마토그래피, 분취 HPLC, 또는 이 둘을 결합한 방식을 사용하여 목표 화합물이 다량으로 정제됩니다. 해당 기법들을 함께 사용한 경우, 최종 고순도를 달성할 수 있도록 플래시 크로마토그래피를 사전 정제 단계 및 분취 HPLC에 적용합니다. 화합물 분리에 성공한 다음에는 증발 또는 동결 건조로 두 번째 농축 단계를 수행합니다. 이 시점에서는 융점 분석, 분석용 HPLC, 효소 검사 등 다른 기법을 사용하여 화합물의 순도와 기능을 분석할 준비가 됩니다.

합성 또는 추출 이후의 전체 워크플로우는 그림 1에 나와 있습니다

그림 1. 일반 추출 또는 합성 워크플로우에서의 정제 워크플로우

흡착 컬럼 크로마토그래피는 액체 크로마토그래피의 최초 형태로, 100년도 전에 러시아계 이탈리아인 식물학자 Mikhail Tsvet에 의해 발견되었으며, 그는 이 크로마토그래피 공정 유형을 사용하여 식물의 색소를 분리했습니다. 이후 크로마토그래피 기법은 매우 빠르게 발전하여 합성 및 추출 실험실에서 필수적으로 사용하는 분석법이 되었습니다.  

흡착 크로마토그래피의 경우, 분리는 샘플 성분과 고정상 및 이동상 간의 상호 작용에 따라 좌우됩니다. 다른 화학적 특성(극성)을 지닌 화합물은 이동상 및 고정상에 대해 서로 다른 친화성 또는 접착력을 보입니다. 친화성은 분자의 2가지 특성인 흡착과 탈착의 영향을 받습니다. 흡착은 특정 성분이 고정상에 들러붙는 능력을 의미합니다. 탈착(또는 용해성)은 혼합물의 성분이 이동상에서 녹는 정도를 의미합니다. 개별 샘플 성분이 고정상을 통과해 이동하는 속도는 그림 2에 나온 것처럼 해당 성분의 흡착/탈착 특성에 따라 달라집니다. 

그림 2. 흡착 대 탈착  

플래시 크로마토그래피 대 분취 HPLC 기법 

고압을 활용한 첫 간행물은 1970년대 말에 플래시 크로마토그래피라는 분석법과 함께 등장했습니다. 이뿐만 아니라 분석용 HPLC 시스템의 크기를 늘려 이 시스템을 분취 크로마토그래피(분취 HPLC)에도 사용할 수 있도록 하였습니다. 오늘날 두 기법은 흔하게 사용되고 있으나, 각각의 목표는 서로 다른데, 플래시 크로마토그래피는 대용량 샘플을 적절한 분해능으로 정제하는 사전 정제 단계로서 주로 사용되는 반면, 분취 HPLC의 목표는 보다 적은 로딩 용량 하에 최고 분해능(순도)을 얻는 것입니다.

따라서 두 크로마토그래피 기법은 표 2에 나와 있듯이 고정상에 사용하는 물질(다른 입자 크기), 카트리지 또는 컬럼의 크기(내부 직경(ID) 및 길이) 그리고 이동상의 유속이 서로 다릅니다.

표 2. 플래시 크로마토그래피와 분취 HPLC 간의 차이