Cromatografia

Os tipos mais utilizados de cromatografia são a cromatografia gasosa e a cromatografia líquida. A diferença está relacionada ao estado físico da fase móvel na cromatografia em coluna. Na cromatografia gasosa, a fase móvel é um gás que transporta a amostra através de uma fase estacionária sólida, enquanto na cromatografia líquida a fase móvel é um solvente. A interação dos compostos com a fase estacionária, um processo conhecido como modo de separação, é controlada por diferenças de polaridade, tamanho ou afinidades de ligação específicas. O modo de separação por cromatografia determina o tipo de técnica de cromatografia líquida (Tabela 1). 

Tabela 1. Tipos de cromatografia líquida

Fluxo de trabalho de purificação por cromatografia

A cromatografia de adsorção em coluna é a parte principal de um fluxo de trabalho típico de isolamento e purificação para fármacos, produtos químicos, condimentos e outros. Inicialmente, as substâncias são quimicamente sintetizadas ou extraídas de plantas, bactérias ou outros organismos vivos. A evaporação é usada para concentrar o material e simplificar o processamento posterior. Se a amostra for nova e desconhecida, será realizada uma seleção para condições ideais de separação por cromatografia, geralmente por cromatografia em camada delgada (TLC) ou métodos analíticos de cromatografia líquida de alta pressão (HPLC). Uma vez encontradas as condições adequadas, o processo cromatográfico é elevado para a cromatografia preparativa. Na etapa preparativa, o composto-alvo é purificado em altas quantidades, seja por cromatografia flash, HPLC prep ou uma combinação das duas. Se as técnicas forem utilizadas em conjunto, a cromatografia flash será aplicada para a etapa de pré-purificação e HPLC prep, para alcançar a alta pureza final. Após a separação bem-sucedida dos compostos, uma segunda etapa de concentração é realizada por evaporação ou liofilização. Nesse ponto, o composto está pronto para análise de sua pureza e função por outras técnicas, incluindo análise de ponto de fusão, HPLC analítica e ensaios enzimáticos.

O fluxo de trabalho completo após a síntese ou extração é mostrado na Fig. 1.

Figura 1. O fluxo de trabalho de purificação em um fluxo de trabalho geral de extração ou síntese

A cromatografia de adsorção em coluna foi a primeira forma de cromatografia líquida, descoberta há mais de 100 anos por Mikhail Tsvet, um botânico russo-italiano, que usou esse tipo de processo cromatográfico para separar os pigmentos nas plantas. Desde então, a técnica de cromatografia se desenvolveu muito rapidamente, transformando-se em um método essencial aplicado em laboratórios de síntese e extração.  

Na cromatografia de adsorção, a separação é controlada pelas interações dos componentes da amostra com as fases estacionária e móvel. Compostos com diferentes propriedades químicas (polaridades) apresentam afinidades variadas, ou pontos fortes de adesão, em direção à fase móvel e à fase estacionária. A afinidade é influenciada por duas propriedades moleculares, adsorção e dessorção. Adsorção refere-se à capacidade de um determinado componente de se aderir à fase estacionária. A dessorção, ou solubilidade, descreve o quão bem um componente da mistura se dissolve na fase móvel. A velocidade com que os componentes individuais da amostra migram através da fase estacionária depende das suas propriedades de adsorção/dessorção, como mostrado na Fig. 2. 

Figura 2. Adsorção versus dessorção  

Cromatografia flash versus técnica de HPLC prep 

A primeira publicação usando pressão elevada foi lançada no final dos anos 1970 com um método chamado cromatografia flash. Além disso, foram feitas tentativas de aumentar o tamanho dos sistemas de HPLC analítica e, assim, disponibilizá-los também para cromatografia preparativa (HPLC prep). Atualmente, ambas as técnicas são frequentemente utilizadas, mas com objetivos diferentes: a cromatografia flash é usada principalmente como uma etapa de pré-purificação para purificar grandes quantidades de amostra em uma resolução satisfatória, enquanto na HPLC prep o objetivo é alcançar a maior resolução (pureza) sob a condição de menores capacidades de carga.

Portanto, as duas técnicas de cromatografia diferem quanto ao material utilizado para a fase estacionária (tamanho de partícula diferente), à dimensão do cartucho ou coluna (diâmetro interno [DI] e comprimentos) e à vazão da fase móvel, conforme mostrado na Tabela 2.

Tabela 2. Diferenças entre cromatografia flash e HPLC prep